Kaggle生物信息学挑战：酶稳定性预测大赛

背景介绍

酶的稳定性是影响其实际应用的关键因素之一。通过定点突变可以改善酶的稳定性,但实验筛选稳定性突变体的成本较高。
预测突变对酶稳定性的影响,加速筛选稳定性更高的酶突变体。

概念解释

**X 残基**：假设它用红色表示， **Y 残基**：假设它用蓝色表示， **Z 残基**：假设它用紫色表示

突变前的角度 θ：
- 在突变发生之前，红色的 X 残基 位于中心，蓝色的 Y 残基 和 紫色的 Z 残基 分别位于它的两侧。它们之间形成了一个特定的角度 θ。
- 这个角度 θ 表示的是 Y 和 Z 残基通过中心残基 X 的空间几何关系。这个角度可能与蛋白质的功能（如活性位点的构象）密切相关。
突变后的角度 θ'：
- 当 红色的 X 残基 发生突变时（例如从一种氨基酸变为另一种氨基酸），它的侧链结构或电荷特性发生变化，导致其在三维空间中的位置发生移动。
- X 残基 的移动可能会牵拉或推动相邻的 蓝色 Y 残基 和 紫色 Z 残基，导致它们之间的角度发生变化。新的角度用 θ' 表示。
- 突变后的角度 θ' 可能与原先的角度 θ 不同，这种变化可能会影响蛋白质的整体结构和功能。

数据解释

train.csv和train_updates_20220929.csv: 训练数据集,包含已知序列及其稳定性(熔点tm)的数据。模型可以从中学习序列与稳定性之间的关系。

test.csv: 测试数据集,包含目标酶(GenBank: KOC15878.1)的2,413个单点突变体的序列。参赛者需要预测这些突变体的tm值。

sample_submission.csv: 预测结果提交的格式示例文件。

wildtype_structure_prediction_af2.pdb: 目标酶的野生型三维结构,由AlphaFold2预测得到。这为基于结构的特征提取和建模提供了重要先验信息

这个数据中包含了对某个蛋白质序列(protein_sequence)进行突变(mutation)后的稳定性预测信息。解释下各列的具体含义:

seq_id: 突变的唯一编号,可能是为了区分不同的突变而设置的流水号。

protein_sequence: 完整的蛋白质氨基酸序列。

pH: 进行稳定性预测时设定的pH值,这里为8。蛋白质的稳定性会受pH影响。

location: 发生突变的位点,即突变前的氨基酸在序列中的位置。

wild_type: 突变前的野生型氨基酸。

mutation: 突变后的氨基酸。如果该列为空,表示是一个deletion突变,即缺失突变。

mutation_type: 突变的类型,这里有substitution(替换突变)和deletion(缺失突变)两种。

因此这个数据详细记录了在某pH值下,蛋白质序列中的特定位点发生特定突变后,对其稳定性产生的影响。这种计算突变对蛋白质稳定性影响的方法,可用于指导蛋白质工程和定向进化实验,筛选出稳定性更高的蛋白质突变体。

wildtype_structure_prediction_af2.deepddg.ddg

这个数据展示了蛋白质的一个位点(ResID为1,野生型氨基酸为V)发生不同突变后,对蛋白质稳定性的影响。详细解释:

chain: 表示这些突变发生在蛋白质的A链上。蛋白质可能由多条肽链组成,用不同字母区分。

WT: 表示Wild Type,即野生型氨基酸,这里为V(Valine,缬氨酸)。

ResID: 表示Residue ID,即残基编号,这里为1,表示突变发生在肽链的第一个氨基酸上。

Mut: 表示Mutant,即突变后的氨基酸。这里列出了除V以外的19种氨基酸,分别用它们的单字母代码表示。

ddG (kcal/mol): 表示每个突变对蛋白质稳定性的影响,单位为kcal/mol。

ddG > 0表示突变后蛋白质变得更稳定
ddG < 0表示突变后蛋白质变得更不稳定

从数据可以看出,所有可能的单点突变(即V突变为其他19种氨基酸)都会降低蛋白质的稳定性(ddG都为负值)。

方案一

DeepDDG方法简介

DeepDDG是一个用于预测蛋白质点突变引起的稳定性变化(ΔΔG值)的深度学习方法。
它基于蛋白质的三维结构,提取突变位点及其周围残基的结构特征和进化特征,用神经网络建模并预测突变引起的ΔΔG值。
提取的特征包括:二面角(φ,ψ,ω)、溶剂可及表面积(SASA)、二级结构(onehot编码)、氢键数量、残基间Ca-Ca距离、残基间取向(Ca-Ca,Ca-C,Ca-N的单位向量)、位置特异性打分矩阵(PSSM)、多序列比对位点出现频率(PFS)、深度突变扫描(DMS)等。
DeepDDG利用了蛋白质数据库中大量已有的实验测定的ΔΔG数据进行训练。训练数据集中包含了与待预测蛋白质同源性较高的一些蛋白质。

`测试集`新增列

每个突变体的 edit 数量(除了一个完全匹配野生型序列的)
点突变的类型:插入(insertion)、缺失(deletion)或替换(substitution)
突变发生在野生型序列中的位置索引
野生型该位置的氨基酸残基
突变体中插入或替换的氨基酸残基(如有)

import Levenshtein
def get_mutation_info(_row, _wildtype="VPVNPEPDATSVENVALKTGSGDSQSDPIKADLEVKGQSALPFDVDCWAILCKGAPNVLQ" \
                                      "RVNEKTKNSNRDRSGANKGPFKDPQKWGIKALPPKNPSWSAQDFKSPEEYAFASSLQGGT" \
                                      "NAILAPVNLASQNSQGGVLNGFYSANKVAQFDPSKPQQTKGTWFQITKFTGAAGPYCKAL" \
                                      "GSNDKSVCDKNKNIAGDWGFDPAKWAYQYDEKNNKFNYVGK"):
    terminology_map = {"replace":"substitution", "insert":"insertion", "delete":"deletion"}
    req_edits = Levenshtein.editops(_wildtype, _row["protein_sequence"])
    _row["n_edits"] = len(req_edits)  # 计算突变数量

    if _row["n_edits"]==0:  # 如果没有突变,则其他突变信息为空
        _row["edit_type"] = _row["edit_idx"] = _row["wildtype_aa"] = _row["mutant_aa"] = pd.NA
    else:
        _row["edit_type"] = terminology_map[req_edits[0][0]]  # 获取突变类型
        _row["edit_idx"] = req_edits[0][1]  # 获取突变位置索引
        _row["wildtype_aa"] = _wildtype[_row["edit_idx"]]  # 获取野生型氨基酸
        _row["mutant_aa"] = _row["protein_sequence"][req_edits[0][2]] if _row["edit_type"]!="deletion" else pd.NA  # 获取突变型氨基酸
    return _row

def revert_to_wildtype(protein_sequence, edit_type, edit_idx, wildtype_aa, mutant_aa):
    if pd.isna(edit_type):
        return protein_sequence
    elif edit_type!="insertion":
        new_wildtype_base = protein_sequence[:edit_idx]
        if edit_type=="deletion":
            new_wildtype=new_wildtype_base+wildtype_aa+protein_sequence[edit_idx:]
        else:
            new_wildtype=new_wildtype_base+wildtype_aa+protein_sequence[edit_idx+1:]
    else:
        new_wildtype=protein_sequence[:edit_idx]+wildtype_aa+protein_sequence[edit_idx:]
    return new_wildtype

test_df = test_df.progress_apply(get_mutation_info, axis=1)  # 对测试集逐行进行突变信息提取
test_df[["protein_sequence", "edit_type", "edit_idx", "wildtype_aa", "mutant_aa"]]

在原有 test_df 的基础上增加了一些新的列,包括:

n_edits: 突变的数量
edit_type: 突变的类型(substitution, insertion, deletion)
edit_idx: 突变发生的位置索引
wildtype_aa: 突变位置的野生型氨基酸
mutant_aa: 突变后的氨基酸(如果是deletion则为空)

DeepDDG服务器预测ΔΔG

DeepDDG服务器预测单点突变引起的折叠自由能变化(ΔΔG)具体步骤为:

使用 AlphaFold2 预测野生型酶的3D结构
将野生型结构文件提交到 DeepDDG 服务器
服务器预测每个可能的突变位点的 ΔΔG 值
将预测结果与测试集突变数据匹配,得到每个突变体的预测 ΔΔG（代码如下）

import pandas as pd
import numpy as np

#helper function
def read_list_from_file(list_file):
    with open(list_file) as f:
        lines  = f.readlines()
    return lines

#读取DeepDDG预测结果
ddg = read_list_from_file('../input/submit-novozymes-00/wildtype_structure_prediction_af2.deepddg.ddg.txt')

header = ddg[0]
data = [s.split() for s in ddg[1:]]

df = pd.DataFrame(data, columns = ['chain', 'WT', 'ResID', 'Mut', 'ddG'])
df.ddG = df.ddG.astype(np.float32)
df.ResID = df.ResID.astype(int)  
df.loc[:,'location'] = df.ResID -1  #change to 0-indexing

#读取测试集突变信息
test_df = pd.read_csv('../input/submit-novozymes-00/test.more.csv')
test_df.location = test_df.location.fillna(-1)
test_df.location = test_df.location.astype(int)

#生成提交文件 
if 1:
    df.loc[:,'mut_string'] = df.WT+df.location.astype(str)+df.Mut
    test_df.loc[:,'mut_string'] =  test_df.wild_type+test_df.location.astype(str)+test_df.mutation
    
    test_df = test_df.merge(df[['ddG','mut_string']], on='mut_string',how='left')  # 将预测的ddG值与测试集突变信息匹配
    submit_df = pd.DataFrame({
        'seq_id': test_df.seq_id.values,
        'tm': test_df.ddG.values,  # 直接使用ddG作为Tm预测值
    })
# test_df.ddG.values这里,直接将DeepDDG预测的ΔΔG值作为Tm的预测值。
# 这是因为比赛的评估指标是Spearman相关系数,它衡量的是预测值和真实值的排序相关性,而不是绝对值的接近程度。
# 所以这里做了一个简化的假设:ΔΔG的正负和大小能够反映ΔTm的正负和大小。虽然它们不是严格的线性关系,但
# 是在一定范围内,ΔΔG越大,ΔTm也越大;ΔΔG越小,ΔTm也越小。基于这个假设,直接用ΔΔG作为ΔTm的预测,可以在
# 一定程度上起到排序的作用。
    submit_df.tm = submit_df.tm.fillna(0)
    submit_df.to_csv('deepddg-ddg.csv', index=False) #lb0.335
    print(submit_df)
  
print('submit_df ok!')

"wildtype_structure_prediction_af2.deepddg.ddg.txt" : 在 DeepDDG 服务器上的预测结果

每一行代表一个可能的氨基酸突变,包含了突变的位置、野生型和突变型氨基酸以及预测的ΔΔG值，ΔΔG为负绝对值越大说明突变会提高稳定性,在图中表现为深红色。

问题思考

通过思考下面的问题来回顾以上的讲解：

DeepDDG 的训练数据中是否包含与测试酶相似的蛋白?
ΔΔG 与目标值 ΔTm 之间有何关联?

ΔΔG和ΔTm都是表征蛋白质稳定性变化的热力学参数,它们之间有一定的关联,但不是简单的线性关系。
ΔΔG (Gibbs自由能变化的变化) 表示由于突变导致的蛋白质稳定性的变化。ΔΔG为正值说明突变降低了稳定性,为负值说明突变提高了稳定性。它反映了突变前后蛋白质折叠态和解折叠态之间平衡的移动。
ΔTm (熔点温度变化) 表示突变导致的蛋白质热稳定性的变化,即蛋白质发生热变性所需温度的变化。ΔTm为正表示突变提高了热稳定性,为负表示降低了热稳定性。
根据热力学理论,ΔΔG与ΔTm之间存在如下关系:ΔΔG = ΔH × (1/Tm_wild - 1/(Tm_wild + ΔTm))其中ΔH为蛋白质折叠的焓变化,Tm_wild为野生型蛋白质的熔点。可以看出,ΔΔG与ΔTm之间不是简单的线性关系,而是还依赖于ΔH和Tm_wild。但在一定范围内,我们可以近似认为:

- 如果ΔΔG为正(突变降低稳定性),则ΔTm也为负(突变降低热稳定性)。
- 如果ΔΔG为负(突变提高稳定性),则ΔTm也为正(突变提高热稳定性)。
所以DeepDDG预测的ΔΔG在一定程度上可以反映ΔTm的变化趋势,但要想准确预测ΔTm的值,可能还需要考虑ΔH,Tm_wild等其他因素的影响。上述代码中直接用ΔΔG作为ΔTm的预测只是一个很粗略的近似。

AlphaFold2 预测的结构特征对本次比赛的作用如何?
DeepDDG 的网络结构是怎样的?

方案二

特征工程

1.使用突变残基周围21个残基的三维坐标信息构建结构特征,包括相对距离、夹角。

受这篇论文[1]的启发，我选择了离突变残基最近的21个残基来构建结构特征

2.利用B-factor、BLOSUM矩阵、DeMaSk、SASA等已有特征。

3.使用Facebook预训练的蛋白质transformer ESM提取序列嵌入特征。

4.使用PCA对嵌入特征进行降维。

构建三个XGB模型

1.XGB1:使用1800+行的训练集,特征包括ESM提取特征、B_factor、相对距离等。

2.XGB2:使用来自30个同源、相同pH组的986个突变的训练集,特征与XGB1相同。

3.XGB3:使用外部数据集中6000多行不稳定突变样本,仅使用结构特征。

集成多个公共模型

1.NESP 3D geometry:使用突变残基与蛋白质中心之间的距离作为特征。

2.FoldX:利用FoldX软件计算ddG值。

3.ThermoNet v2:使用体素化的3D结构特征和辅助的dTm目标训练CNN模型。

4.Relaxed rosetta scores:使用Rosetta软件计算relax结构的能量分数。

5.RMSD:根据分子动力学模拟轨迹计算每个残基的RMSD。

6.Different pLDDT:计算突变型与野生型的pLDDT差异。

XGB模型和公共模型进行加权集成

构建三个XGBoost模型的策略允许利用不同的数据集和特征,从多个角度学习蛋白质稳定性与突变之间的关系,并通过集成学习提高最终预测的鲁棒性和准确性。这种方法在处理复杂的生物学问题时非常有效。